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厌氧菌的分离、培养及鉴定
  • 发布日期:2014-01-17      浏览次数:4263
    •  一 摘要: 
      1.1 实验内容: 
      厌氧菌的分离、培养及鉴定; 
      1.2 目的: 
      1 掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。 
      了解厌氧菌菌鉴定的一般方法。 
      2 复习并巩固平时所学的微生物知识与技能。 
      3 培养独立思考、设计和动手实验的能力。 
       
      二 介绍: 
      厌氧微生物在自然界分布广泛,种类繁多,其生理作用日益受到人们的重视。 
      专性厌氧菌,对氧气非常敏感,因此,他们的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。 
       
      厌氧菌的培养: 
      在培养厌氧菌时,zui需要控制的是厌氧条件,在pH=7.0,O2的浓度与1atm的氧平衡时,O2——O2-反应的电位是0.81V,因此,在-0.33V时,O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。所以说,要保证厌氧菌培养时的低电位是很重要的。 
      厌氧菌的培养方法很多,如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施,操作步骤多,较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术,亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术 因此他是世界上*个分离纯化厌氧菌的人。 
      以后这项技术又经历了几十年的不断改进,从而使亨盖特厌氧技术日趋完善,并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术,而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是:预还原培养基制好后,可随时取用进行试验;任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。 
       
      三 实验材料与设备: 
      3.1 分离与培养: 
      3.1.1菌种:待测样品; 
      3.1.2 培养基:改良的PRAS培养基(氮素自加) 
      [配方组成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青(还原指示剂)1ml,121摄氏度灭菌20min.使用前每5ml培养基加入1%Na2S(还原剂)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制剂)各0.1ml] 
      3.1.3 试剂:冰块 Na2S NaHCO3 
      3.1.4 器材:高纯氮气 厌氧管 厌氧手套箱 注射器 恒温培养箱 铜柱除氧系统 定量加样器 厌氧罐 超声波破碎仪 酒精灯 冰块 水浴锅 记号笔 振荡器 等 
      3.2 菌种的鉴定: 
      3.2.1 菌种:待测菌 
      3.2.2 培养基;糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基(液体); 
      3.2.3 试剂;乙醚 吲哚试剂 卢戈氏碘液; 
      3.2.4 器材:超净工作台 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅 接种环 移液管载玻片 显微镜 等 
       
      四、实验方法与步骤: 
      4.1分离与培养 
      4.1.1 铜柱系统除氧 
      铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40~400mm,两端被加工成漏斗状,外壁绕有加热带,并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管,一端连接气钢瓶,另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2 和H2等都含有微量O2,故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时,铜和气体中的微量O2化合生成CuO,铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时,H2与CuO中的氧就结合形成H2O,而CuO又被还原成了铜,铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用,并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 
       
      4.1.2 预还原培养基及稀释液的制备 
      在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下,制作预还原培养基及稀释液时,先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧,而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中,一般琼脂培养基装4.5~5.0mL,稀释液装9mL,并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红zui后变成无色,说明试管内已成为无氧状态,然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖,于灭氧罐中灭菌备用。 
       
      4.1.3 分离 
      (1)编号 
      取五支无菌水试管,分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。 
      (2)稀释 
      在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下,用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品,加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中,用震荡器将其混合均匀,制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中,制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释,至10-6,制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。 
      (3)滚管分离 
      1)滚管 
      将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化,置46-50℃恒温的水浴中,待用,当培养基从瓶中取出时,要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气,赶走所有管内空气,然后把培养基加入管内,立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内,及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL,分别注入待用的试管中,然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动,带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。 
      2)分离纯化 
      生成的菌落需挑取出来,镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物,需再次稀释滚管,并再次挑取菌落,直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定,做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上,打开试管胶塞,同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时,另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内,找准待挑菌落,轻轻吸取,转移至液体试管内,加塞。37℃培养,培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。 
      3)划线分离 
      将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下,挨着打气针塞住管口,在针头快速取下前,通气15-20s,管口一端在火焰上烧片刻。旋紧管塞,划线后的卷管直立保温,使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重,开启后管塞不致有空气残留。划线后的滚管,置34-37度下培养,便可长出菌落。 
       
      4.1.4 镜检与计数 
      (1)镜检 
      挑取特征性菌落制片,革兰氏染色后镜检,观察菌体形态。 
      (2)计数 
      液体纯培养物经系列稀释后,按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数,计算每克或每毫升样品中含有厌氧菌数量cfu/g(mL)样品=A×10ml×X/10×D 
      A-0.1mL滚管计数的实际平均值; 
      X- 镜检呈现为厌氧菌的数目; 
      X/10-菌落中厌氧菌的概率; 
      D- 稀释倍数 
       
      4.2 菌种的鉴定 
      4.2.1糖发酵试验 
      糖发酵实验是zui常用的生化反应,在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖的能力上有很大差异,有些细菌能分解糖并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气,不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8(紫色)],当发酵产酸时,可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 
      具体实验步骤: 
      ① 将菌液进行适当稀释,之后在无菌环境下,取一定量的稀释液注入生化鉴定管中,用无菌封口膜封口。 
      ② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中,充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。 
      ③ 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。 
      4.2.2 蛋白质分解实验 
      ① 将菌液进行适当稀释,之后在无菌环境下,取一定量的稀释液注入生化鉴定管中,用无菌封口膜封口。 
      ② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中,充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。 
      ③24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。 
      4.2.3 淀粉水解实验 
      ① 将菌液进行适当稀释,之后在无菌环境下,取一定量的稀释液注入生化鉴定管中,用无菌封口膜封口。 
      ② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中,充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。 
      ③ 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。 
       
      五 注意事项及注释: 
      1 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。 
      2 注意无菌操作,保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。 
      3 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后,如需再次吸取,应快速将注射器插入厌氧管中,以防止针头污染。 
      4树脂刃天青(resazurin)既是还原剂又是指示剂,它可以把培养基中残留的溶解氧去除,其氧化还原电位指示敏感范围为-42mV。有氧时呈紫色或粉红色,无氧时呈无色(培养基的颜色),它是较为理想的氧化还原电位指示剂和培养严格厌氧菌不可缺少的。 
      5培养基中加入的青霉素是用来抑制其它细菌生长的,因为厌氧菌的细胞壁成分为假肽聚糖,不受青霉素影响。 
      6注射器在使用前必须先用培养基上面的气体冲洗、填充,然后插入培养基的下层,以保证当培养基移入试管时,就处于无氧气体层的下面。
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